Tuy nhiên, vào năm 1468, Alfonso đột ngột qua đời khi chỉ được 14 tuổi. Nguyên nhân cái chết vẫn chưa được xác định, nhưng có khả năng là do một căn bệnh nào đó như bệnh lao hoặc dịch hạch (mặc dù có tin đồn rằng Alfonso đã bị kẻ thù đầu độc).

Alfonso được chôn cất gần cha mình, (sau này di hài của Isabel của Bồ Đào Nha cũng được an táng tại đây) tại Tu viện Miraflores, được ủy quyền bởi Nữ vương Isabel I. [3] Năm 2006, trong quá trình trùng tu tu viện, Tổng cục Di sản Văn hóa và Tài sản của Junta de Castilla y León đã quyết định thực hiện một nghiên cứu nhân chủng học về các ngôi mộ. Hài cốt của Alfonso, được đặt trong một chiếc quan tài bằng gỗ óc chó, được tìm thấy trong tình trạng bảo quản kém. Chiều cao của Alfonso được ước tính là 165 cm. [4]

Vào năm 2013, một nghiên cứu chi tiết hơn dựa trên những kết quả này đã được Đại học León công bố với giả thuyết rằng Alfonso thực chất đã bị hạ độc, vì các triệu chứng không giống với các triệu chứng của bệnh dịch hạch thể hạch và hài cốt của Alfonso cũng không có dấu vết của vi khuẩn Yersinia pestis. [5]

Theo ý nguyện của mình, ngai vàng sẽ được kế thừ bởi chị gái Isabel, người được đề nghị thay thế em trai trở thành biểu tưởng của quân nổi loạn. Ngay sau đó, Isabel đã từ chối, và sau một cuộc đàm phán tại Toros de Guisando, Isabel và đồng minh của mình đạt được hầu hết mục tiêu, Enrique đã chấp thuận loại trừ con gái Juana khỏi vị trí kế vị và công nhận Isabel là người thừa kế chính thức của mình. Mặc dù Enrique tiếp tục chống lại quyết định này khi có thể, nhưng nỗ lực của Enrique IV không thành công, và quốc vương vẫn duy trì thế hòa hảo với Isabel trong suốt triều đại của mình. Isabel cũng trở thành vị vua tiếp theo của Castilla khi Enrique IV qua đời vào năm 1474.